Diminuição da suscetibilidade do Plasmodium falciparum tanto à diidroartemisinina quanto à lumefantrina no norte de Uganda

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 6353 (2022) Citar este artigo

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A resistência parcial à artemisinina pode facilitar a seleção de Plasmodium falciparum resistente a medicamentos associados à terapia combinada. Avaliamos 99 isolados de P. falciparum coletados em 2021 no norte de Uganda, onde surgiram mutações PfK13 C469Y e A675V associadas à resistência, e no leste de Uganda, onde essas mutações são incomuns. Com o ensaio de sobrevivência do anel ex vivo, isolados com a mutação 469Y (sobrevida média de 7,3% para mutante, 2,5% misto e 1,4% tipo selvagem) e/ou mutações em Pfcoronin ou falcipain-2a tiveram uma sobrevida significativamente maior; todos os isolados com sobrevida >5% apresentaram mutações em pelo menos uma dessas proteínas. Com ensaios de inibição do crescimento ex vivo, a susceptibilidade à lumefantrina (IC50 mediana 14,6 vs. 6,9 nM, p < 0,0001) e di-hidroartemisinina (2,3 vs. 1,5 nM, p = 0,003) diminuiu no norte vs. leste de Uganda; 14/49 isolados do norte vs. 0/38 do leste tinham IC50 de lumefantrina > 20 nM (p = 0,0002). O sequenciamento direcionado de 819 isolados de 2015–21 identificou múltiplos polimorfismos associados à suscetibilidade alterada a medicamentos, notadamente PfK13 469Y com suscetibilidade diminuída à lumefantrina (p = 6 × 10−8) e mutações PfCRT com resistência à cloroquina (p = 1 × 10−20) . Nossos resultados levantam preocupações sobre a atividade de artemeter-lumefantrina, o antimalárico de primeira linha em Uganda.

A resistência aos medicamentos tem desafiado o tratamento e controle da malária falciparum por décadas1. A resistência parcial às artemisininas, as drogas mais importantes atualmente usadas no tratamento da malária, foi identificada no sudeste da Ásia há cerca de 15 anos2,3. O fenótipo de resistência parcial acarreta eliminação retardada de parasitas após o tratamento de pacientes com artemisininas4, ou maior sobrevida de parasitas cultivados após exposição à diidroartemisinina (DHA)5. Foi demonstrado que a resistência parcial no sudeste da Ásia está associada a qualquer uma das cerca de 20 mutações candidatas ou validadas no domínio propulsor da proteína P. falciparum kelch 13 (PfK13)6,7. Polimorfismos adicionais acompanharam mutações de PfK13 em parasitas do sudeste asiático resistentes à artemisinina,8,9 e a seleção in vitro de parasitas africanos com DHA levou a uma eliminação tardia associada a mutações em P. falciparum coronin (Pfcoronin)10. Mutações PfK13 validadas como mediadores de resistência no sudeste da Ásia foram relatadas em algumas outras partes do mundo11,12,13, mas até recentemente faltavam evidências de prevalência sustentada dessas mutações ou resistência clínica ou in vitro documentada14. A maior preocupação tem sido o potencial surgimento ou disseminação da resistência para a África, onde a maior parte da morbidade e mortalidade da malária é observada15. Recentemente, mutações PfK13 previamente ligadas à resistência parcial à artemisinina na Ásia foram descritas na África Oriental, com o surgimento da mutação PfK13 R561H em Ruanda16,17,18 e as mutações C469Y e A675V no norte de Uganda19,20,21,22. Em estudos limitados, as mutações C469Y, R561H e A675V demonstraram estar associadas à resistência parcial à artemisinina medida clinicamente (depuração retardada) ou in vitro (sobrevida aumentada)17,22, mas nossa compreensão dos impactos do P. falciparum recentemente emergido As mutações na sensibilidade aos medicamentos e a eficácia do tratamento das principais terapias combinadas à base de artemisinina (ACTs) na África estão incompletas.

Os ACTs combinam uma artemisinina de ação rápida com um fármaco parceiro de ação mais lenta23. No sudeste da Ásia, o surgimento de resistência parcial à artemisinina foi seguido por evidências de diminuição da atividade antimalárica dos medicamentos parceiros do ACT, mefloquina24 e piperaquina25. Notavelmente, a resistência a artemisininas, associada principalmente à mutação PfK13 580Y, e à piperaquina, associada a novas mutações em PfCRT e amplificação do gene plasmepsina 2/3, levou a taxas de falha para DHA-piperaquina > 50% no Camboja26,27,28. O recente surgimento de resistência parcial às artemisininas na África Oriental pode, de forma semelhante, levar à seleção de parasitas com sensibilidade diminuída aos medicamentos parceiros da ACT. Considerando o enorme número de vítimas da malária na África, essa consequência pode ser devastadora, como foi visto com o surgimento da resistência à cloroquina na década de 1980, levando a milhões de mortes por malária em excesso29.

20 nM (p = 0.0002; Fig. 2). RSAs, which entailed counting parasites 72 h after initiation of a 6 h DHA pulse, did not show significant differences in survival between isolates from northern (median 2.5% survival for 52 samples) and eastern (median 1.4% survival for 29 samples; p = 0.53) Uganda, but of note some parasites with PfK13 mutations associated with delayed parasite clearance were present at both sites (Fig. 2)./p>5% had either the PfK13 469Y mutation, mutations in falcipain-2a, or both. Interestingly, mutations in PfK13 outside the propeller domain were associated with decreased RSA survival (the opposite of the effect of PfK13 469Y); considering any of 15 non-propeller mutations identified, survival was 1.5% in 42 mutant vs. 5.5% in 26 fully wild type isolates (p = 0.02; Supplementary Table 2). Two other polymorphisms with significant independent associations were deletion in a putative ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 1, associated with increased RSA survival, and a SNP in a gene encoding a protein of unknown function, associated with decreased survival./p>30 nM (median IC50 39.5 nM), subsequent IC50 values measured after culture for 4 or more weeks and then after freezing, thawing, growth in culture, and repeat assays, were generally lower than the initial ex vivo values (Table 5). However, after culture adaptation IC50 values for these eight northern Uganda isolates measured before (median IC50 13.2 nM) or after (median IC50 16.9 nM assessed in Uganda and 7.4 nM assessed in the USA) freeze-thaw-reculture were above values for parasites collected from eastern Uganda for direct comparison with the northern Uganda isolates (median IC50 6.9 nM for 38 isolates) or for a larger set of isolates published earlier (median IC50 5.1 nM for 365 isolates32)./p>5% despite lack of the PfK13 469Y mutation had mutations in falcipain-2a. Of the 17 mutations identified in falcipain-2a, 11 were also identified in isolates from southeast Asia in which falcipain-2a haplotypes were associated with enhanced RSA survival9. Falcipain-2a is a hemoglobinase that plays a key role, in concert with other proteases, in hydrolyzing hemoglobin to supply amino acids for parasite metabolism43. Loss of falcipain activity due to treatment with specific inhibitors or gene knockout markedly blunted the antimalarial activity of DHA, indicating that falcipain-mediated proteolysis of hemoglobin is needed for efficient activation of artemisinins44. These results are consistent with our understanding that the conversion of artemisinins by heme, after liberation from hemoglobin, into toxic free radicals, is a prerequisite to efficient action of artemisinins45. Interestingly, a mutation encoding a falcipain-2a stop codon was identified in parasites selected in vitro for resistance to artemisinin, but this selection occurred after emergence of a PfK13 mutation6. Taken together, available data suggest that certain mutations in falcipain-2a can mediate artemisinin partial resistance independent of or in concert with mutations in PfK13./p>1% parasitemia were diluted to 1%; isolates with ≤1% parasitemia were cultured at starting parasitemias. The cells were washed to remove drug after 6 h, and culture was continued for an additional 66 h. At 72 h after culture initiation, Giemsa-stained thin smears were prepared. Cultures were considered viable and appropriate for assessment if control parasitemia was ≥0.2% and also ≥25% of the starting parasitemia. Parasitemias were counted in control and treated cultures, and RSA survival was expressed as the proportion of viable parasites in the DHA treated cultures relative to controls./p>15%) prevalence of minor alleles were evaluated independently, as described above, and loci with low (≤15%) minor allele prevalence were analyzed as aggregate variables, in which the presence of any minor allele was compared with the major allele. For both high and low prevalence loci, p ≤ 0.05 were considered significant. For loci that were statistically significant, RSA survival was also evaluated in the context of K13 C469Y and A675V mutations. Candidate loci and K13 genotypes were treated as binary variables as described above./p>