Editores de base de citosina aprimorados gerados a partir de variantes de TadA

Nature Biotechnology volume 41, páginas 686–697 (2023)Cite este artigo

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Os editores de base de citosina (CBEs) permitem mutações de transição genômica C·G-para-T·A programáveis ​​e normalmente compreendem uma enzima CRISPR-Cas modificada, uma citidina desaminase natural e um inibidor do reparo de uracil. Estudos anteriores mostraram que CBEs utilizando desaminases de citidina de ocorrência natural podem causar desaminação de citosina não guiada em todo o genoma. Embora tenham sido relatados posteriormente CBEs aprimorados que diminuem os alvos estocásticos em todo o genoma, esses editores podem sofrer de desempenho abaixo do ideal no alvo. Aqui, relatamos a geração e a caracterização de CBEs que usam variantes projetadas de TadA (CBE-T) que permitem alto C·G a T·A no alvo em um conjunto diversificado de sequências de loci genômicos, demonstram atividade robusta em células primárias e não causam nenhuma elevação detectável na mutação de todo o genoma. Além disso, relatamos editores de bases de citosina e adenina (CABEs) que catalisam a edição A-to-I e C-to-U (CABE-Ts). Juntamente com ABEs, CBE-Ts e CABE-Ts permitem a instalação programável de todas as mutações de transição usando variantes TadA desenvolvidas em laboratório com propriedades aprimoradas em relação aos CBEs relatados anteriormente.

Os editores de base de citosina (CBEs) são enzimas de edição de genes capazes de introduzir de forma programável alterações de pares de bases C·G-para-T·A no DNA genômico de células vivas. Essa conversão química é obtida por desaminação hidrolítica mediada por enzimas de citosina em uracil, que é interpretada como timina pelas DNA polimerases1. Até o momento, os CBEs são tipicamente compostos por quatro componentes distintos: uma citidina desaminase de ocorrência natural (como APOBEC, AID ou CDA)2, uma forma prejudicada de Cas9 capaz de cortar a cadeia de DNA não editada por base, uma ou mais unidades de peptídeo inibidor de uracil glicosilase (UGI) e uma sequência de localização nuclear (NLS)1,2,3. Esses componentes são tipicamente fundidos de forma covalente, mas também podem ser montados de forma não covalente4. Os CBEs têm sido amplamente explorados para reversão de genes e engenharia celular e têm o potencial de fornecer benefícios terapêuticos para pacientes que vivem com doenças genéticas debilitantes ou malignidades5.

Embora a alta eficiência de edição de DNA no alvo possa ser alcançada com as atuais ferramentas de edição de base CBE2, elas também podem causar edição fora do alvo independente de RNA guia (gRNA) em todo o genoma6,7. Editores CBE de próxima geração, como YE1 (ref. 8), BE4-PpAPOBEC9 e outros10, foram relatados para mitigar resultados fora do alvo independentes de gRNA, mas esses editores usam variantes naturais ou levemente modificadas da APOBEC desaminase e podem sofrer diminuição em -alvo de desempenho de edição2,9. Além disso, em alguns contextos específicos de sequência, os CBEs baseados em APOBEC podem levar à edição proximal adjacente à sequência genômica alvo devido à capacidade ineficiente, mas mensurável, de APOBEC de aceitar DNA de fita dupla (dsDNA) como substrato11.

Os editores de base de adenina (ABEs) são enzimas de edição de genes que instalam de forma programática mutações pontuais de A·T para G·C em loci direcionados por meio de uma TadA desaminase desenvolvida em laboratório que converte quimicamente adenina em inosina12. A base da inosina pareia com a citosina dentro do sítio ativo das polimerases de DNA, resultando em uma mutação de inosina para guanina após a replicação do DNA. Notavelmente, os ABEs causam alvos independentes de gRNA de baixo a nenhum e editam o DNA genômico (gDNA) dentro de uma janela mais precisa (posições ~ 3–8, PAM 21–23), o que pode resultar em menos alvos dependentes de guia como bem como menos edições de bystander, em relação aos CBEs6,13. Além disso, não foi relatado que os ABEs atuem no dsDNA.

Para conferir os atributos favoráveis ​​de ABEs a um CBE, imaginamos transformar TadA em uma enzima capaz de desaminação de citidina robusta e subsequentemente geramos uma classe melhorada de CBEs que usa TadA em vez de uma citidina desaminase natural. De forma encorajadora, investigações anteriores demonstraram a maleabilidade dos ABEs em relação à edição C para T baixa, mas detectável, por meio da inclusão de UGI14. De fato, por meio do design guiado pela estrutura, foi relatada uma variante de ABE, ABE-P48R-UGI, que permitia uma maior atividade de citosina, em relação a ABE7.10, mas com alta especificidade de sequência TC15. Embora esses avanços representem um progresso em direção aos nossos objetivos, reconhecemos que seria necessária mais engenharia e evolução de TadA para alcançar eficiências de edição C·G-para-T·A terapeuticamente relevantes com alta pureza de produto e sem restrições de sequência de substrato.